肝内胆管癌（ICC）预后较差，与肝内胆管结石有关，细菌在ICC的发生发展中起重要作用，其中E. coli E. coli 与ICC恶性进展的相互作用，以及ICC细胞中SGs组装的机制进行探究。
2024年2月17日，福建医科大学陈实副教授团队在 Advanced Science 上发表了题为 Escherichia coli-Induced cGLIS3-Mediated Stress Granules Activate the NF-κB Pathway to Promote Intrahepatic Cholangiocarcinoma Progression 研究论文，本研究通过构建体外和体内ICC模型以及患者源性类器官(PDOs)，表明 E. coli 诱导一种新的RNA cirglis3 (cGLIS3)的产生，促进肿瘤生长，同时揭示了ICA与GP化疗联合使用可作为ICC一种有效治疗策略。
研究团队使用伯桢生物的肝内胆管癌试剂盒 Cholangiocarcinoma Organoid Kit(Serum-free) （货号：K2104-LB） 成功构建肝内胆管癌类器官。通过构建来自肝内胆管细胞癌（ICC）患者的癌细胞类器官模型，作者主要验证了ICA（阿可拉定）在ICC治疗中的作用以及ICA与GP（吉西他滨加顺铂）联合治疗的效果。在本研究中，类器官作为个性化癌症治疗模型在药效检测方面发挥了重要作用。
临床数据分析表明，伴有肝内胆管结石的ICC患者预后较差，E. coli 在肝内胆管结石相关ICC患者的胆汁中比例最高，且E. coli 阳性的ICC患者总体生存期和无进展生存期较差。作者通过建立大肠杆菌和 ICC 的体外间接共培养模型，观察这种环境对肿瘤进展的影响。F-肌动蛋白染色结果显示，共培养组中的ICC细胞表现出更具侵袭性的表型，通过Transwell 和 3D 迁移测定表明其增强了迁移能力，并且对吉西他滨的耐药性增加。同样地，作者使用构建的患者来源类器官（PDO）模型，也发现同时患有 ICC 和肝内胆管结石的患者来源的 PDO 对吉西他滨表现出更强的耐药性。结果证明，E. coli 促进ICC细胞的侵袭、迁移、对吉西他滨的耐药性。体内实验证实，E. coli 刺激的ICC细胞具有更强的转移能力。RNA-seq分析表明，E. coli 刺激导致ICC细胞中NF-κB等经典炎症通路富集，RNA加工相关基因富集，SGs组装增加。（图1）
图1 E. coli 促进ICC进展和SGs组装
E. coli 促进ICC进展是通过上调cGLIS3环化和SGs形成
E. coli 处理后，ICC细胞中剪接因子eIF4A3的mRNA和蛋白表达显著改变。据文献报道，eIF4A3可促进并维持SG的稳定性，且与circRNA的环化有关。通过对ICC患者组织和共培养的ICC细胞进行RNA-seq，筛选出20个差异表达的circRNAs，进一步RT-qPCR实验结果证明，只有cRSPKC6和cGLIS3在eIF4A3过表达和大肠杆菌刺激后表现出差异变化。IF结果显示，敲低cGLIS3减少了由大肠杆菌诱导的SGs数量的增加，这表明大肠杆菌可能通过上调eIF4A3的表达，进而增加cGLIS3的环化来促进SGs的形成。作者通过设计收敛和发散引物来扩增GLIS3 RNA的典型和反向剪接异构体，再通过PCR以及使用发散引物的Sanger测序确认了头尾剪接位点，核糖核酸酶R抗性分析证实了cGLIS3是由人类基因组9号染色体上GLIS3的外显子2环化产生。随后，作者通过RNA免疫沉淀（RIP）实验明确cGLIS3与eIF4A3相互作用关系，并证实eIF4A3可以结合到cGLIS3前体mRNA外显子的两侧，促进环状化。接下来，通过体外实验证明，cGLIS3过表达进一步增强了E. coli 预处理后ICC细胞的迁移能力以及对吉西他滨的耐药性，而敲低则产生相反的效果。体内实验也证实，过表达cGLIS3的ICC细胞转移能力更强。综上所述，E. coli 可通过上调eIF4A3的表达介导cGLIS3的反向剪接，从而促进SG的形成，最终影响 ICC 的迁移和耐药性。（图2）
图2 E. coli 通过上调cGLIS3的环化促进SGs形成
cGLIS3/hnRNPA1/G3BP1复合物通过SGs促进ICC进展
作者使用生物素标记的cGLIS3正义和反义探针在Hccc9810和HuccT1细胞中进行cGLIS3-RNA下拉实验，细胞质谱分析以及RIP实验结果证实了hnRNPA1/G3BP1与cGLIS3之间的结合。随后作者通过RNA pull-down、RIP和免疫荧光实验，确定了cGLIS3与hnRNPA1/G3BP1结合的关键环（HR3和HR5），以及hnRNPA1和G3BP1与circGLIS3相互作用的关键区域（hnRNPA1的14-184区域和G3BP1的255-419区域）。实验结果表明，E.coli刺激后，hnRNPA1和G3BP1的蛋白表达上调，cGLIS3在转录后水平调节它们的蛋白表达。过表达cGLIS3增加了hnRNPA1和G3BP1的蛋白水平和半衰期。接下来探究cGLIS3是否参与调节hnRNPA1和G3BP1的泛素化，于是作者使用K48-Ub、Flag-G3BP1和cGLIS3探针进行外源性转染。蛋白酶体抑制剂MG132处理显著降低了cGLIS3表达细胞中hnRNPA1和G3BP1的K48泛素化，cGLIS3的敲低显著增加了Hccc9810细胞中K48泛素化的Flag-G3BP1的积累。结果证实，cGLIS3通过抑制K48相关的多泛素化来稳定hnRNPA1和G3BP1。作者构建cGLIS3-HR3-MUT和cGLIS3-HR5-MUT细胞，研究结果表明，cGLIS3-HR3-MUT和cGLIS3-HR5-MUT不促进SGs形成，也不能稳定hnRNPA1和G3BP1在SGs中的结合，且它们在促进ICC进展方面的作用也丧失。综上所述，cGLIS3抑制K48相关的多泛素化，稳定了cGLIS3/hnRNPA1/G3BP1多元复合物，从而稳定SGs并促进ICC进展。（图3）
图3 cGLIS3/hnRNPA1/G3BP1复合物通过SGs促进ICC进展 作者通过测序结果观察到，伴有肝内胆管结石的ICC患者与NF-κB通路的激活具有相关性。沉默cGLIS3后NF-κB通路抑制因子IKKα蛋白表达上调，过表达后则下调，且E. coli 对IKKα在转录水平没有调节作用。RNC测序分析表明，SGs可能主要影响IKKα mRNA的翻译。免疫荧光实验显示，ICA对SGs形成的抑制作用显著，且能降低cGLIS3水平，同时降低了Hccc9810细胞被E. coli 刺激或cGLIS3过表达增强的迁移能力和耐药性。综上所述，当cGLIS3过表达时，SGs阻断了IKKα mRNA的翻译，导致NF-κB通路持续激活，从而促进ICC的侵袭、迁移和化疗耐药。（图4）
图4 SGs通过激活NF-κB信号通路促进ICC进展
为了研究cGLIS3在体内的作用，作者首先使用从患有肝内胆管结石的ICC患者身上获取的癌细胞构建了类器官模型，并且使用钙黄绿素-AM（绿）和EthD-1（红）染料对活/死细胞进行活力定量测定，证实ICA联合GP显著增强了对癌细胞的杀伤效果。裸鼠皮下模型和肺转移模型中验证了ICA的效果，GP-ICA组均显示出最高的抗肿瘤效果。并且在皮下模型中发现GP-ICA通过有效地沉默cGLIS3而增加了IKKα水平的程度，从而降低了NF-κB通路。这些发现为患有肝内胆管结石的ICC患者的进展提供了一种新的分子机制，并证明了ICA在这一特定患者群体中的关键作用。（图5）
图5 ICA与GP联合有效抑制ICC进展
E. coli 通过上调剪接因子eIF4A3的表达，促进SGs的组装，导致NF-κB通路的持续激活，增强ICC的恶性程度。通过构建包括患者来源类器官（PDOs）在内的体外和体内 ICC 模型，证明大肠杆菌通过产生circGLIS3（cGLIS3）促进了肿瘤的生长，而抑制cGLIS3的诱导性上调便是ICC有前途的诊断和治疗靶点，为circRNA在癌症中的功能重要性增添了新的维度。本研究揭示了ICC治疗的新机制和策略，即ICA与GP化疗联合使用可能是ICC的一种有前途的治疗策略。
