结直肠癌（CRC）作为最常见的消化系统恶性肿瘤，是世界范围内第二常见的癌症相关死亡原因。脂质代谢作为癌细胞的重要代谢特征，已被广泛报道参与癌症的发生、进展和耐药过程。FASN是脂质代谢的核心酶，可催化FA从头生物合成，维持细胞存活和促进细胞增殖。lncRNA是长度超过200个核苷酸的转录本，它们可以通过调节mRNA转录、翻译和翻译后修饰来调节蛋白质编码基因的表达。lncRNA已经成为肿瘤发生发展中的关键角色，然而，lncRNA在CRC中的生物学功能和潜在机制尚不清楚。
2024年3月16日，徐州医科大学宋军教授团队在 Molecular Cancer 在线发表题为“ The m⁶A modification mediated-lncRNA POU6F2-AS1 reprograms fatty acid metabolism and facilitates the growth of colorectal cancer via upregulation of FASN ”的研究论文，在本研究中鉴定出一种新型lncRNA POU6F2-AS1，其在CRC中表达显著上调，与CRC患者的不良临床结果呈正相关。该研究表明POU6F2-AS1的上调在CRC的脂肪酸代谢中起关键作用，可能为CRC提供一种新的有前景的生物标志物和治疗靶点。
该研究团队使用伯桢生物的结直肠癌（无血清）类器官培养试剂盒Colorectal Cancer Organoid Kit(Serum-free)（ K2103-CR ）成功构建了结直肠癌类器官并完成了全文类器官相关实验。基于类器官模型，研究团队发现POU6F2-AS1敲低会抑制结直肠癌PDO的形成，而POU6F2-AS1过表达则促进PDO的形成，与前期临床和细胞数据一致。在本研究中，类器官作为优秀的体外模型在机制验证方面发挥了重要作用。
POU6F2-AS1在结直肠癌中的鉴定及临床意义分析
研究团队通过对基因表达综合（GEO）数据库中四个公开可用的数据集（GSE126092、GSE134525、GSE109454和GSE84983）进行分析，发现lncRNA POU6F2-AS1表达水平在这些数据集中均显著上调。利用癌症基因组图谱（TCGA）数据库进行分析，结果显示POU6F2-AS1在CRC组织中的表达水平显著高于正常组织，并与晚期TNM（肿瘤结节转移）分期呈正相关。与此同时，与FHC细胞（人正常结直肠粘膜细胞）相比，POU6F2-AS1在HCT116、SW480、DLD1、SW620、HT29和LoVo 等CRC细胞中显著上调。随后，研究团队使用荧光原位杂交（FISH）和qRT-PCR进行检测，结果显示POU6F2-AS1在CRC组织中的表达显著上调。采用卡方检验分析POU6F2-AS1表达与临床病理特征的关系，并通过生存曲线和COX回归分析POU6F2-AS1在CRC中的预后价值，结果表明POU6F2-AS1是CRC患者总生存期（OS）的重要预后因素。总之，POU6F2-AS1可能作为CRC新型致癌lncRNA，具有潜在的诊断和治疗价值。（图1）
图1 POU6F2-AS1在结直肠癌中的鉴定及临床意义分析
POU6F2-AS1在体外促进结直肠癌细胞和类器官增殖
研究团队首先对CRC细胞系中内源性POU6F2-AS1表达水平进行检测，结果显示在HCT116和SW480细胞中，POU6F2-AS1表达水平显著上调，而在LoVo细胞中，POU6F2-AS1表达相对较低。为了进一步确定POU6F2-AS1在CRC细胞中的生物学功能，研究团队在HCT116和SW480细胞中对POU6F2-AS1进行敲低，而在LoVo细胞中过表达POU6F2-AS1。CCK-8、EdU和集落形成结果显示，POU6F2-AS1敲低显著抑制CRC细胞的增殖，而POU6F2-AS1过表达则促进了CRC细胞增殖。此外，患者源性类器官（PDO）数据也显示POU6F2-AS1过表达可以促进PDO的形成。总之，POU6F2-AS1可以促进CRC细胞和PDO的增殖。（图2）
图2 POU6F2-AS1在体外促进结直肠癌细胞和类器官增殖
POU6F2-AS1介导的新生脂肪生成对结直肠癌细胞和类器官的体外生长至关重要
研究团队对转染POU6F2-AS1过表达质粒和空载的CRC细胞进行比较，检测到两者存在2030个差异表达基因。KEGG富集分析显示，显著富集的途径包括代谢途径、癌症途径、细胞周期、结直肠癌及癌症中心碳代谢。GO富集分析显示，显著富集的生物过程包括脂质代谢和FA代谢。通过亲脂性荧光染料BODIPY 493/503染色、油红O染色以及细胞内甘油三酯（TAG）含量检测的实验结果表明敲低POU6F2-AS1降低了CRC细胞中的脂质储存和TAG含量，而POU6F2-AS1过表达增加了CRC细胞中的脂质储存和TAG含量。更重要的是，液相色谱-质谱显示敲低POU6F2-AS1可显著降低CRC细胞中的FAs水平。qRT-PCR和Western Blotting的结果显示敲低POU6F2-AS1显著降低了FA合成酶（FASN、ACC1和SCD1）在mRNA和蛋白质水平的相对表达，而对FA β-氧化酶（CPT1A）和FA吸收分解酶（CD36）的表达没有影响。总之，POU6F2-AS1可能通过促进FA合成，进而调节CRC细胞的脂质代谢。（图3）
图3 POU6F2-AS1介导的新生脂肪生成对结直肠癌细胞和类器官的体外生长至关重要
POU6F2-AS1与YBX1相互作用促进结直肠癌细胞生长和脂肪生成
研究团队通过生物素标记的RNA下拉和质谱分析筛选了潜在的POU6F2-AS1结合蛋白，在HCT116细胞中拉下了大约64种与POU6F2-AS1相互作用的潜在蛋白，结合RBPDB数据库和RBPmap数据库预测的RNA结合蛋白（RBPs）分析显示，发现只有YBX1是POU6F2-AS1的潜在结合蛋白并且POU6F2-AS1和YBX1共定位于CRC细胞的细胞核和细胞质中。缺失定位分析显示，POU6F2-AS1的117-195nt区域对于其与YBX1的相互作用是不可或缺的。RIP检测结果表明YBX1的CTD结构域206-324氨基酸是与POU6F2-AS1相互作用所必需的。此外，在POU6F2-AS1稳定过表达的LoVo细胞中敲低YBX1，观察到POU6F2-AS1过表达促进了细胞增殖和脂肪生成，且这些影响在YBX1敲除后被减弱。总之，POU6F2-AS1可能通过直接结合YBX1驱动CRC细胞增殖和脂肪生成。（图4）
图4 POU6F2-AS1与YBX1相互作用促进结直肠癌细胞增殖和脂肪生成
POU6F2-AS1将YBX1连接到FASN启动子上转录激活FASN
为了进一步阐明POU6F2-AS1/YBX1轴驱动CRC肿瘤和脂肪生成的机制及该轴的下游靶点，研究团队对POU6F2-AS1和YBX1共同调控的脂质代谢相关基因进行评估。Venn图显示，四个基因（FASN、INSIG1、OLAH和SCD）是POU6F2AS1/YBX1轴的潜在靶点。Western Blotting和qRT-PCR检测显示，在HCT116细胞中，由于敲低POU6F2-AS1导致的FASN表达下调可以通过过表达YBX1进行恢复；同理，在LoVo细胞中，由于过表达POU6F2-AS1诱导的FASN表达水平上调会因为敲低YBX1而被削弱。荧光素酶报告基因检测显示YBX1结合位点位于FASN启动子的-447/-136区域，在POU6F2-AS1敲除细胞中，YBX1过表达可显著恢复FASN启动子的激活，而在POU6F2-AS1过表达细胞中，YBX1敲低显著减弱了FASN启动子的激活。染色质免疫沉淀（CHIP）分析显示YBX1在FASN启动子内结合的具体位点是P2-4区域，同时，敲低POU6F2-AS1降低了FASN启动子P2-4区域YBX1的富集。免疫组化染色结果显示CRC组织中FASN表达比正常组织明显上调。此外，FASN的异位过表达显著恢复了POU6F2-AS1敲低对CRC细胞增殖和脂肪生成以及PDO生长的抑制作用。总之，POU6F2-AS1将YBX1连接到FASN启动子上，诱导FASN的转录激活，且POU6F2-AS1对CRC细胞增殖和脂肪生成的促进部分依赖于FASN。（图5）
图5 POU6F2-AS1将YBX1连接到FASN启动子上转录激活FASN
POU6F2-AS1在体内驱动结直肠癌细胞增殖和脂肪生成
为了进一步验证POU6F2AS1/FASN轴在体内促进CRC细胞增殖和脂肪生成的作用，研究团队进行了HCT116细胞生长试验和小鼠肿瘤异种移植模型实验。结果显示POU6F2-AS1敲低显著抑制细胞增殖，降低肿瘤体积和重量，但FASN过表达逆转了这些影响。此外，IHC和油红O染色显示，敲低POU6F2-AS1降低了FASN蛋白水平，抑制了肿瘤细胞增殖，降低了脂质含量，而FASN过表达可逆转这些效果。总之，POU6F2-AS1在体内可以促进CRC细胞增殖和脂肪生成。（图6）
图6 POU6F2-AS1在体内驱动结直肠癌细胞增殖和脂肪生成
m6 A修饰参与结直肠癌中POU6F2-AS1的上调
已有文献报道N6-甲基腺苷（m6A）修饰参与了肿瘤中lncRNAs的稳定和表达。同时，研究团队通过SRAMP网站预测发现多个m6 A位点分散在POU6F2-AS1序列中，而甲基转移酶样3（METTL3）和胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（IGF2BP2）是关键的m6 A甲基转移酶“写入器”和“读取器”，于是研究团队对METTL3和IGF2BP2的表达及其与TCGA数据库中POU6F2-AS1的相关性进行评估。结果显示，在CRC细胞中，METTL3和IGF2BP2的表达在CRC组织中显著上调，并与POU6F2-AS1表达呈正相关。免疫组化染色进一步证实了POU6F2-AS1表达与METTL3和FASN表达呈正相关。质粒转染结果显示METTL3敲低导致POU6F2-AS1表达水平和稳定性明显降低，而METTL3过表达具有相反的效果。MeRIP分析还显示敲低METTL3降低了SW480细胞中POU6F2-AS1的m6 A修饰水平。此外，SW480细胞中IGF2BP2的敲低显著降低了POU6F2-AS1的表达和半衰期。同时，METTL3敲低后，IGF2BP2与POU6F2-AS1之间的相互作用也被抑制。总之，METTL3介导的m6 A修饰通过IGF2BP2依赖的RNA稳定作用，促进了POU6F2-AS1在CRC中的表达。（图7）
图7 m 6 A的修饰参与了结直肠癌中POU6F2-AS1的上调
POU6F2-AS1是一种新发现的在CRC中上调的lncRNA，通过METTL3介导的m6 A修饰维持稳定。此外，POU6F2-AS1将YBX1特异性连接至FASN启动子以激活其转录，调节脂质代谢，促进CRC的进展。总之，POU6F2-AS1在致癌METTL3/POU6F2-AS1/YBX1/FASN轴中发挥着关键作用，促进CRC细胞增殖和脂肪生成，为CRC中的脂质积累提供了新的见解，并强调了POU6F2-AS1作为CRC患者的一个有前景的治疗靶点。
