2023年9月，复旦大学生命科学院王陈继教授团队、复旦大学附属肿瘤医院叶定伟教授团队、戴波教授团队和西南医科大学附属医院徐富江主任医师团队携手在Cancer Research在线发表题为DPP9 Stabilizes NRF2 to Suppress Ferroptosis and Induce Sorafenib Resistance in Clear Cell Renal Cell Carcinoma的研究论文，本研究证明DPP9通过竞争性结合KEAP1，稳定NRF2蛋白水平，激活氧化应激信号，抑制ccRCC的铁死亡，从而驱动肿瘤的发展和索拉非尼耐药。
研究团队使用伯桢生物的肾癌（无血清）类器官培养试剂盒Kidney Cancer Organoid Kit (Serum-free)（K2171-KC），成功构建了肾透明细胞癌类器官并完成了全篇类器官实验。作者发现与对照组相比，缺乏DPP9的类器官对索拉非尼更加敏感，进一步证实且补充了相关实验数据。在本研究中，类器官作为个性化癌症治疗模型在机制验证和药效检测方面发挥了重要作用，为科学研究提供了强有力支持。
作者进一步探究KEAP1是否针对DPP9进行泛素依赖性降解，结果显示过表达KEAP1并不能改变异位共表达DPP9的蛋白水平。外源性KEAP1的诱导导致NRF2蛋白水平时间依赖性降低，而DPP9蛋白水平保持不变。在293T和786-O细胞中，敲除KEAP1没有改变DPP9但显著上调NRF2的蛋白水平。在293T细胞中用siRNA对DPP9进行敲降，导致NRF2的蛋白水平下调。在786-O和CCF-RC1细胞中敲除DPP9，或在OSRC2和769-P中用siRNA敲降DPP9，均可导致NRF2、HMOX1和SLC7A11蛋白水平下调。过表达DPP9-WT会以剂量依赖的方式增加NRF2、HMOX1和SLC7A11的蛋白水平。在786-O细胞中敲除DPP9缩短了NRF2的半衰期，过表达DPP9则相反，表明DPP9正向调控了NRF2蛋白的稳定性。使用DPP9酶抑制剂1G244处理786-O细胞并不影响NRF2的蛋白水平，表明DPP9的酶活性对于调节NRF2没有影响。DPP9-WT降低了KEAP1-NRF2的结合亲和力以及NRF2的泛素化。IHC分析显示，DPP9和NRF2的表达在ccRCC队列中呈正相关。紧接着，作者通过RNA-seq研究发现，在已报道的322个NRF2的转录靶点中，包括SLC7A11，HMOX1，AIFM2，TXNRD1和TXN在内的多个基因在DPP9 KO 的786-O细胞中显著下降。随后通过qRT-PCR实验证实了HMOX1和SLC7A11 mRNA水平的下调，而过表达DPP9-WT，则上调了HMOX1和SLC7A11的mRNA水平。综上所述，DPP9通过与KEAP1竞争性结合来稳定ccRCC细胞中的NRF2，并且DPP9正向调控NRF2通路的转录输出。（图3）
图3 DPP9通过竞争性地结合KEAP1来促进NRF2的稳定性和核内积累
DPP9以KEAP1结合依赖的方式调节细胞ROS水平
NRF2是一个中和ROS以及恢复细胞氧化还原平衡的中央枢纽。由于DPP9可以促进NRF2蛋白的稳定性，作者探讨了DPP9是否影响ccRCC细胞的氧化还原平衡。实验结果显示H2O2处理后，DPP9 KO 786-O细胞中NRF2的核定位远弱于对照组，而对照组细胞中KEAP1与DPP9之间的结合有所增强。此外，与对照组相比，H2O2对DPP9 KO 786-O细胞中NRF2、HOMX1和SLC7A11的诱导作用更弱，将DPP9-WT重新引入DPP9 KO 786-O细胞逆转了这些表现。综上所述，过表达DPP9降低了细胞ROS水平，从而导致ccRCC细胞抵抗氧化应激诱导的细胞死亡。（图4）
图4 DPP9以KEAP1结合依赖的方式调节细胞ROS水平
DPP9过表达以SLC7A11依赖的方式抑制铁死亡
过表达DPP9诱导SLC7A11的上调，SLC7A11参与谷胱甘肽（GSH）生物合成，从而保护细胞免受氧化应激和铁死亡。RNA-seq数据的基因集合富集分析（GSEA）表明，受DPP9敲除影响的基因在铁死亡过程中富集。利用利培罗染色监测铁死亡过程中的脂质过氧化水平，结果显示在DPP9 KO中利培罗信号更强，通过重新引入DPP9-WT可以逆转这个现象。此外，作者发现在DPP9 KO 786-O细胞中恢复SLC7A11的表达可逆转铁死亡诱导剂erastin诱导的细胞死亡，并在很大程度上逆转了DPP9敲除导致的GPX4酶活性、MDA水平以及细胞GSH水平的变化。这些结果表明DPP9以SLC7A11依赖的方式抑制铁死亡。（图5）
图5 DPP9过表达有助于通过SLC7A11依赖的方式抑制铁死亡
DPP9过表达有助于ccRCC对索拉非尼的耐药性
索拉非尼是一种多激酶抑制剂，最初被提出通过抑制SLC7A11活性作为铁死亡的有效诱导剂。作者发现，在786-O和CCF-RC1细胞中过表达DPP9，抑制了索拉非尼诱导的细胞死亡。索拉非尼处理后导致DPP9 KO 786-O细胞死亡情况比对照组更严重，重新引入DPP9-WT后，逆转了细胞对索拉非尼的敏感程度。此外，过表达DPP9-WT导致786-O细胞对索拉非尼产生了耐药性。DPP9 KO显著抑制了786-O和CCFRC1异种移植瘤的生长，并增强了索拉非尼诱导的肿瘤抑制。通过ccRCC患者组织来源的类器官数据表明，缺乏DPP9的类器官更容易受到索拉非尼诱导的细胞死亡。通过分析IHC检测到的26例索拉非尼治疗的转移性ccRCC标本中DPP9的表达，作者发现与索拉非尼敏感患者相比，索拉非尼耐药患者中DPP9的表达更高。对110例TKI治疗患者的RNA-seq数据集的分析表明，高DPP9表达与较低的无进展生存期和OS相关。综上所述，DPP9过表达有助于ccRCC对索拉非尼的耐药性。（图6）
